1497年夏天，列奥纳多还忙于绘制《最后的晚餐》。那一年的修道院的总帐目中有一个条目记录了支付给一些工人37里拉，“他们为列奥纳多绘制信徒的那个修道院餐厅的一个窗户做了一些活。”1497年6月29日，卢多维科给他的秘书马尔凯西诺·斯坦戈写了封信，在信中他说他希望“那个佛罗伦萨人列奥纳多能尽快完成他在修道院餐厅的工作”，然后他就能够“参与到餐厅另一面墙上的工作中了”。这里我们或许可以嗅出公爵已经有些不耐烦了。
众所周知，列奥纳多的著名壁画在不很顺利的情形之下却有许多创新。他将油画颜料与蛋彩画颜料混合起来使用，而不是采用传统的在新鲜的灰泥上涂抹颜料的画法，后者更适合用于绘制壁画。借助这种画法，他可以慢慢地创作，不满意还可以重画，但是这种画法的缺点马上就暴露出来：颜料已经开始剥落。湿气这个内在的问题使这种情况进一步恶化。列奥纳多还在世的时候这幅壁画的表面就已经开始恶化。1517年，日记作者安东尼奥·德·贝蒂斯在日记中写道，这幅壁画“开始损坏”，而到16世纪50年代瓦萨里看到这幅画的时候，壁画上“除了一团污渍其他什么都看不清”。[319]毫无疑问，这就是很早就有许多临摹此画的作品出现的原因，其中有两幅——一幅是马可·德奥焦诺画的，一幅是贾姆彼得利诺画的，这两位画家大概也参与了原画的创作。这也是出现大范围的和强制性修复工程的原因。最早有文字记载的修复工作是在18世纪早期，但很可能之前已经有过修复活动了。20世纪30年代，在把这幅壁画的现状与这些早期的复制品以及温莎皇家图书馆里的预备性习作进行比较之后，肯尼思·克拉克痛惜那些麻木不仁的修复者使这幅画失去了人物表情的细微之处。他还认为，“那些具有米开朗基罗《最后的审判》的风格的过于痛苦的表情”表明了“16世纪软弱的风格主义的风格”。
这幅画与生俱来的脆弱现在却似乎成为其魅力的一部分。仅仅几十年之内，这幅画就化成了“一团污迹”，19世纪早期它惨遭拿破仑士兵的故意破坏，1943年夏天差一点被盟军的炸弹击中，能保留到今天真是一个奇迹！
最近的也是最有野心的一次修复工作是在皮尼·布拉姆比拉·巴切伦的领导下于1999年开始了。之前二十多年的时间，用在修复此画身上的花费估计高达200亿里拉（约相当于600万英镑）。这次修复工作在很大程度上就是要把以前的修补工作留下的叠印去掉，即将罩光漆和覆盖色的结壳处理掉，用微小的痂使原画结痂，希望某些原作的颜料还留在下面。用巴切伦的话说，人们像对待一个“重病人一样”对待这幅画。不管是在什么时候，总有人对艺术品的修复工作大肆批评，声称这会使原作“失去灵魂”，但必须承认我们现在看到的《最后的晚餐》已比较接近五百多年前列奥纳多和他的助手画在那面墙上的、班代洛睁大眼睛看到的那幅画。虽然此画与原作十分接近，但也只是部分接近，原作的表面大约只有20％保留下来。这幅画像鬼魂一样附着在那面墙上，残缺不全却重新赋予作品令人着迷的表情和姿势，简单却令人信服的最后的晚餐的细节：只有半杯葡萄酒，桌布上的细丝织法，情绪激动的圣彼得手中紧握着的那把凶器一般的刀。