不久之后，列奥纳多又用红粉笔画了一幅草图，后来这幅红粉笔画又被其他人用墨水描了一遍，该图现存放在威尼斯学院美术馆。该草图显得比较粗糙，很大程度上应归咎于墨汁的影响，不过《最后的晚餐》的均匀的布局在这幅草图上已初显端倪。众门徒被分成了几组，画面更注重人物的个性特征。为了明确人物身份，人物形象下面出现了匆忙写就的说明文字（其中菲利普被提到了两次）。但犹大仍然在桌子的靠近观者的一侧，约翰依然睡得很沉。
这些素描让我们看到了列奥纳多关于此画的早期想法。他迅速而聚精会神地做好微型蓝图，心中不停问自己——是这样画还是那样画？但正如列奥纳多常会表现的那样，他的绘画基础非常扎实，尽管这些素描是第一批真正为圣玛利亚感恩教堂的《最后的晚餐》所作的习作，但我们在他的素描簿中找到了另一张年代更早的纸张，可以追溯到15世纪80年代，上面画着三幅互有关联的素描：一群人坐在桌子旁边，有一人单独坐在桌前，双手托着脑袋，还有一个人毫无疑问就是耶稣，他的手指指向那个命中注定的碟子。这三幅素描并不是为《最后的晚餐》所作的习作，因为画中只有五个人坐在桌旁愉快地聊天以打发时间，他们并不是耶稣的门徒。画中场景可能是发生在某次乡村的欢宴中，人们围坐在桌前。但不知是什么激发了列奥纳多的灵感，使他在同一页纸上迅速画下吃圣餐的基督这一令人心酸的场景，十五年之后这个想法终于在那幅伟大的米兰壁画中开花结果。
温莎皇家图书馆和威尼斯藏有的素描的重心逐渐从整体布局转移到单独人物形象特征上面。温莎皇家图书馆藏有著名的系列头像，大多数用红粉笔画成，有一些已经画得比较完整。那些人物形象终于变得清晰起来：犹大、彼得、大雅各、圣菲利普（几乎可以肯定，最后两个形象用的是同一个模特，只不过在图画中被赋予了鲜明的个性特征）。其中有一幅圣约翰双手的习作，画面非常精美；还有一幅习作上画着圣彼得的衣袖。“福斯特笔记本”中还有一些简短的评论，对这些习作进行了补充——某位来自帕尔马的亚历山大为耶稣的手提供原型；“住在比塔的克里斯托法诺·达·卡斯蒂廖内的头部的形状很美”。其中有一处笔记，标题非常简单，就写着“耶稣”两字，列奥纳多在下面写着“摩塔洛红衣主教手下的乔瓦尼·孔蒂”，这个人可能就是耶稣的模特。阿拉贡有位消息灵通人士名叫路易吉，他在1517年亲眼见过《最后的晚餐》，据他记载，画中的一些门徒是“米兰朝臣和知名市民的真实肖像”。
在一个著名的片断中，列奥纳多列出了一些门徒听到基督宣言后的各种反应：
一个正在喝酒的门徒把酒杯放回原位，把头扭向说话人。
一个扭动手指的人，转向他的同伴，表情十分严肃，展开双臂，露出掌心，肩膀上耸，碰到了他的耳朵，惊讶地张大嘴巴……
一人转过身，手里拿了一把刀子，碰倒了桌上的玻璃杯……
一个人身体前倾望着说话者，双手遮住了自己的眼睛。
其中一些人物描写在最后完成的壁画中得到了体现，比如白胡子的圣安德鲁（从左边数第三个人）摊开他的掌心，耸起他的肩膀。而其他人的动作都发生了改变，转过身、手中拿把刀子的那个人变成了圣彼得，而碰倒玻璃杯的则变成了另一个人，他就是打翻盐瓶的犹大。这些姿势中至少有一个早已出现在温莎皇家图书馆收藏的第一幅构图素描中，即人数较少的那组人像中，耶稣和犹大之间的那个人“用手遮住了眼睛”。
与整体构图一样，这些带有感情色彩的动作体现了列奥纳多《最后的晚餐》中崭新的理念：他摒弃了从中世纪流传下来的构图传统，即信徒们沿着桌子呆板地坐成一条直线。在佛罗伦萨，列奥纳多应该看到过塔代奥·加迪、安德烈亚·德尔·卡斯塔尼奥、安吉利科修士和多梅尼科·吉兰达约各自绘制的《最后的晚餐》。吉兰达约是在万圣修道院餐厅绘制的《最后的晚餐》，壁画优雅精致，但缺乏活力，该壁画完成不久列奥纳多才前往米兰。在列奥纳多《最后的晚餐》中，用餐者的线条被打断了，取得了神奇的效果。呈现在我们眼前的是波浪状的一群人，彼得罗·马拉尼把这种波浪形看做是“巴黎手稿C”中的光学图示。门徒们被分成四个组，每组三个信徒：聚集成群的这些信徒突然处在了一个紧要关头。列奥纳多也找到了他戏剧性的一刻：不是圣餐仪式，也不是确认犹大的身份，而是众人在听到耶稣宣布消息时极度震惊的反应——“只有在你们面前我才能肯定地说，你们中间有人将要背叛我。”众信徒悲痛万分。（《马太福音》26:21－2）因而，画面布局的流畅部分是由基督的这个决定造成的，即讲故事的那一刻出现的，几乎就是电影中的一幕。卢卡·帕乔利是最早对这幅壁画作出评论的人之一，他对这一点有过绝佳的诠释。1498年12月14日，他在为自己著的《神圣的比例》一书写的献辞中说道：
在众门徒听到那个声音说出“有人背叛了我”的时候，我们很难想像他们当时的表情专注到什么程度。通过行为和手势，门徒们似乎在互相对话，一个人跟另一个人说，而那个人又跟旁边另一个人讲，都显得惊讶不已。就这样，我们的列奥纳多用他那巧夺天工之手创造了这戏剧性的一刻。