是柏拉图式的爱情游戏，还是真心相爱？笼罩在吉内弗拉画像上的疑问现在出现在列奥纳多的生活中。
1476年4月初，有人将一封匿名举报信投进专门用来检举坏人的容器中，这种容器被放置在城市的大街小巷，人称“桶”，它还有另一个更为形象的名字——“真相之洞”。这封信的一份被公证过的副本保存下来，人们是在“守夜官”和“僧侣道德守望者”的文件中发现的，这两个机构是佛罗伦萨的守夜机构，我们也完全可以将它们称为当时的“刑警队”。信的全文如下：
致执政团的领导：我特此作证有个叫雅科博?萨尔塔雷利的人与哥哥乔瓦尼?萨尔塔雷利一起住在瓦凯雷奇亚大街的金匠店，这家店正好对着这个“桶”。雅科博穿着一身黑衣，17岁上下。就是这个雅科博参与了多起猥亵的勾当，只要有人要他进行这种邪恶的事情，他都答应满足他们的需要。这件事他干过多次，换句话说，他为很多人都提供过这种服务，那些人的底细我心里很清楚，现在我列出部分人的名字。这些人鸡奸过上述那个雅科博。我向天发誓句句属实。
告密者随后列出了四位所谓的雅科博的同伴或客户的名字。他们是：
?巴尔托洛梅奥?迪?帕斯奎诺，金匠，家住瓦凯雷奇亚大街。
?列奥纳多?迪?塞尔?皮耶罗?达?芬奇，与安德烈亚?德尔?韦罗基奥住在一起。
?巴奇诺，紧身上衣制造商，家住奥尔桑米开莱教堂附近，住的街上有两家大型剪羊毛的店铺，街的一头是谢尔奇家的凉廊。巴奇诺新开了一家紧身上衣店。
?列奥纳多?托纳博尼，又名“特里”，一袭黑衣。
这四个名字下面写着：“无条件等待传唤”。此处表明这四个人还没有被抓起来，正在等待进一步的调查，如果受到法庭传唤，必须出庭。两个月之后，也就是6月7日，四个人被传唤出庭。最终法庭似乎是撤消了这起案子。
这份耸人听闻的文件1896年第一次被公之于众，但之前就已经为人所知。在加埃塔诺?米拉内西编辑的瓦萨里《著名画家、雕塑家和建筑家传》（出版于1879年）的第四卷中，他提到列奥纳多曾被人“控告过”，但没有明说是因何罪名。让－保罗?里克特和古斯特沃?乌兹利都提到列奥纳多曾有过犯罪经历，也都未指明是何罪行。乌兹利称之为“恶意的谣言”。在尼诺?斯米拉利亚?斯科纳米利奥最终将那封举报信公布于众之后，他不遗余力地为列奥纳多辩护，说在这件案子里他已“不受怀疑”，还说他“从未参与过违反自然法规的各种形式的恋爱”。
自弗洛伊德以来，很多随后对列奥纳多的研究，像朱塞皮纳?福马戈利的《列奥纳多的性爱》，都矢口否认列奥纳多是个同性恋者，这似乎有些奇怪。现在人们普遍接受的观点是：列奥纳多是同性恋者。至少还有一位早期的列奥纳多的传记作家对这个问题没有含糊其辞，他就是乔瓦尼?保罗?洛马佐，他在写于1564年的《论梦》中想像出下面这段发生在列奥纳多与古代伟大的雕塑家菲迪亚斯之间的对话。菲迪亚斯询问列奥纳多关于一个他“最钟爱的弟子”的情况：
菲迪亚斯：你跟他玩过佛罗伦萨人疯狂迷恋的“后背游戏”？
列奥纳多：太多次了！你应该知道他是一个非常漂亮的年轻人，而且也不过15岁左右。
菲迪亚斯：你这样说难道一点儿都不害臊吗？
列奥纳多：一点儿都不！我干吗要害臊？在品德高尚的人眼里，没有什么能比得上这件事更为光荣的……
洛马佐这里指的是列奥纳多跟他来自米兰的学生贾科莫?卡普罗蒂（又称“萨莱”）的亲密关系。瓦萨里在描写这两人关系的时候则谨慎多了，但他对萨莱的描述可能表达了同样的意思：“他面目俊美，清秀标致，一头小鬈发，列奥纳多看了极为喜欢。”瓦萨里文中用了一个形容词“vago”，意为“清秀标致”，暗示了萨莱身上带有一种“女人气”。列奥纳多生活中出现的其他的同性恋者可能还有：一个名叫保罗的学徒和一个名叫菲奥拉万蒂的青年，这两个人我会在后文介绍。尽管列奥纳多素描簿里的很多画像都是男子裸体，但坦白地说，其中也有一些关于同性恋爱的素描。最明显的一个例子是所谓的《天使变身》，画中人前面的阳具已经完全勃起。人们也因此将这幅画与藏于卢浮宫的《圣约翰》联系起来，《圣约翰》可能是列奥纳多最后一幅画，那是一幅用感伤的笔触画的雌雄同体的年轻男子，他一头鬈发，就像列奥纳多“极为喜欢”的萨莱的鬈发一样，鬈发成为他15世纪70年代初第一幅画之后每幅画中必会出现的物体。
有人一直将列奥纳多的性取向看作是微微发亮的小天使和两性人那种浪漫的、佩特似的模式。但他们必须要辩驳下面这些史料文献，例如《阿伦德尔抄本》的44页，这页上有一个词汇表，上面列有cazzo（它是“阴茎”的粗俗叫法，译为“